Coprocultivo

CBTis

No.155

Coprocultivo

Integrantes:

Flores Hernández Cynthia Giselle

Ramírez Barragán Brenda Berenice

Maestro: Alfaro López Víctor Manuel

Mesa: 3

Grupo: 4L2M

I. INTRODUCCIÓN

coproultivo a la siembra de una muestra adecuada de heces en medios de cultivo apropiados para el desarrollo de bacterias entéricas patógenas. Muestra adecuada es aquella que ha sido recolectada durante el periodo agudo de la enfermedad, cuando es más fácil comprobar presencia de pus, moco o sangre, y antes de la administración de antimicrobianos.

Para realizar el examen se emplean heces que no tengan más de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente del recto con un hisopo de algodón. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1º ml de un líquido conservador, o bien, depositar en éste el hisopo rectal.

OBJETIVO:

Identificar las especies patógenas de las vías gastrointestinales a través del coprocultivo y de sus reacciones bioquímicas

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO

1. 

*Muestra de materia fecal en frasco con tapa.

*Placas estériles de: agar soya tripticaseína, agar EMB, agar endo, agar S-S, agar verde brillante.

*Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo tetrationato.

*Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo nutritivo estéril.

*Mechero, asa, incubadora.

Al día siguiente:

*Placas con coprocultivo.

*Equipo de coloración de Gram

*Serie de tubos de cultivo para pruebas bioquímicas: Agar Kligler, SIM medium, agar citrato de Simmons, agar manitol, caldo urea, caldo dextrosado, caldo V-P, gelatina, leche descremada, etc..

*Mechero, asa, tina, puente, piseta.

*Lámpara de alcohol.

MÉTODO

TOMENSE PRECAUCIONES DE ASEPSIA AL MANIPULAR LOS ESPECIMENES. AL INOCULAR EN LOS TUBOS ES INDISPENSABLE EL USO DE CUBREBOCAS Y GORRA. TRABAJAR SIEMPRE FRENTE A LA FLAMA DEL MECHERO

I) AISLAMIENTO.

1) Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de tetrationato. Inocular con asa por emulsión.

2) De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de caldo nutritivo.

3) Etiquetar con los datos escolares

4) Levar a la incubadora a 37ºC duarnte 24 horas. Colocar los tubos en gradilla de rejilla, de tal manera que se mantengan en posición vertical para evitar que el líquido se derrame.

II) RESIEMBRA.

AL INOCULAR LAS PLACAS, ES INDISPENSABLE EL USO DE CUBREBOCAS Y GORRA. TRABAJAR FRENTE A LA FLAMA.

1) Retirar los tubos de la incubadora.

2) Disponer sobre la mesa una serie de medios selectivos (agar EMB, agar S-S, agar verde brillante y agar soya tripticaseina) para resembrar el cultivo en caldo de tetrationato.

3) Disponer sobre la mesa una serie de los mismos medios selectivos para resembrar el cultivo en caldo nutritivo.

4) Resembrar en cada una de las placas el inóculo correspondiente por la técnica de estrias cruzadas sectoriales. Usar solo una asada para cada placa.

5) Sellar las placas. Etiquetar con los datos escolares

6) Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posición invertida. Mantenerlas durante 24 horas.

Al día siguiente:

1) Retirar las placas de la incubadora.

2) Efectuar análisis macroscópico de cada una para valoración de la PRUEBA PRESUNTIVA respecto a la ferementación de la lactosa, de cauerdo a la siguiente:

GUIA DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA

1. 

La prueba presuntiva para diferenciación de los bacilos entéricos gramnegativos se basa en la valoración de la fermentación de la lactosa sobre medios de cultivo adicionados con este carbohidrato, como el agar endo o el agar EMB:

a) Enterobacilos que producen fermentación rápida de la lactosa: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae.

b) Enterobacilos que producen fermentación lenta de la lactosa: Edwarsiella, Serratia, Citrabacter, Arizona, Providencia, Erwinia.

c) Enterobacilos que no producen fermentación de la lactosa: Shigella, Salmonella, Proteus, Pseudomonas.

COPROCULTIVO

El perfil clínico del paciente será determinante en la elección de los medios de cultivo a inocular. En casos de pacientes ambulatorios se deben inocular medios selectivos para Salmonella, Shighella, y Campylobacter spp. Dos medios de preferencia para éstos patógenos son: Hektoen y XLD. Mac Conkey y Levine es recomendable cuando no es necesario un medio tan selectivo. En adición a éstos medios se debe utilizar Medios especiales para Campylobacter como el Agar Skirrow. Se debe agregar un medio no selectivo Agar Sangre al 5% , este medio es útil para detectar Staphylococcus aureus, levaduras o Pseudomona aeruginosa

ASPECTOS CLINICOS Y PATOGENIA

El conocimiento de los aspectos clínicos de la enfermedad puede dar claros indicios de la etiología de la misma. El tiempo de incubación puede sugerir una agente etiológico particular en epidemias, una historia de reciente utilización de antimicrobianos puede sugerir una enfermedad causada por Clostridium difficile. Una historia de viajes recientes puede sugerir enteropatógenos como Vibrio cholerae , V.parahaemolyticus .o E coli enterotoxigénica. El espectro de las manifestaciones clínicas es amplio y variable, ciertos síntomas pueden manifestarse en ciertas etiologías en particular : disentería ( amebiasis, shighellosis, E.coli enteroinvasiva) Diarrea con sangre (salmonelosis, campylobacteriosis, shighellosis E.coli verocitotogénica.ECET) Deposiciones como “agua de arroz” (cólera) Colitis hemorrágica o sindrome urémico hemolíticoSUH (E.coli verocitotoxigénica) Sindromes apendiculares (yersiniosis) Diarreas de corta incubación con vómitos como característica predominante (toxina Staphylococica).

La gran mayoría de las infecciones gastrointestinales resultan de la ingestión de una dosis suficiente del agente etiológico que permita atravesar las barreras protectoras del organismo como son barrera ácida del estómago, mucosa intestinal, motilidad intestinal, flora microbiana normal, los sistemas inmunes celulares y humorales, y los tejidos linfáticos asociados. Los síntomas pueden ser extremadamente severos en individuos que tengan comprometidos una o más de estas barreras.

El tiempo de incubación de la enfermedad es típicamente de 24 a 48 hrs. para la mayoría de los patógenos bacterianos , pero mucho más largo para otros como Campylobacter ( 3 a 11 días) y ECVT (3 a 5 días). Durante el período de incubación el agente se establece en el intestino, coloniza la mucosa ,se multiplica en grandes números y utiliza estrategias de virulencia como: adherencia, produccion de citotoxinas o enterotoxinas, e invasividad. La toxina del V.cholerae actúa en las células epiteliales de la mucosa a través de un receptor específico-GM1gangliosido-para estimular la adenilciclasa, que lleva al exceso de producción de AMP cíclico; lo que produce una producción excesiva de líquido con gran pérdida de iones Na y bicarbonato . La toxina termolábil y termoestable de la ECET actúan de manera similar resultando en síntomas parecidos al cólera. Otros patógenos entéricos que producen enterotoxinas son:Bacillus cereus y Clostridium perfringens. Las citotoxinas están etiológicamente relacionadas con las complicaciones sistémicas de esta infección como colitis hemorrágica y SUH

En contraste, los agentes etiológicos enteroinvasivos como Shighellae y ECEI tienen la habilidad de penetrar y multiplicarse dentro de las celulas epiteliales de la mucosa del colon produciendo su destrucción. Este proceso es asociado a una inflamación aguda, ulceración, que puede llevar a necrosis de la mucosa, características típicas de la disentería bacilar. El mecanismo de la E.coli enteropatógena es diferente ya que muestran una adherencia característica a las celulas epiteliales de la mucosa que se caracteriza por la destruccion del microvilli y una íntima adherencia a la célula que forma copas o pedestales en la base de las bacterias adheridas.

Los mecanismos de patogenicidad de varios agentes etiológicos aún deben ser dilucidados como: Campylobacter, Salmonella no tifosa, etc.

RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

La muestra de preferencia para el coprocultivo y el aislamiento de agentes bacterianos en diarrea es la muestra de heces recolectada durante el período agudo de la enfermedad. La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio después de obtenida. . Si la demora entre la toma de muestra y el procesamiento de ésta es mayor a dos horas , se debe enviar la muestra en Medio de transporte .La formulación del Medio Cary Blair es adecuada para la recuperación de la generalidad de las bacterias patógenas.

Hasta tres muestras es el número óptimo de coprocultivos para obtener un buen resultado en el aislamiento del agente infeccioso, especialmente cuando los síntomas no son claros y definitivos.

Las tinciones de Gram no son útiles pero la muestra al fresco con tinción de Loeffler puede ayudar a visualizar la presencia de leucocitos fecales, que en grandes números indican procesos inflamatorios. La morfología de los leucocitos predominantes es indicio del agente infeccioso.

patógeno	origen		procedimiento
		enriquecimiento	cultivo	incubación
Aeromonas spp	agua		Agar Sangre Agar CIN	48 hrs.a 35°C aerobiosis
Bacillus cereus	Carnes, Salsas Vegetales	Medio de Carne picada 48Hrs.	Agar SangreSupl Medio BCM	72 hrs.a 35°C Anaerobiosis y serología
Campylobacter C.jejuni C.coli	Agua,animales,carne,aves, leche	Medio líquido Enriquecido x 24hrs.	Medio Skirrow	48 hrs. Microaerofilia A 42°C
Clostridium difficile	Terapia antimicrobiana		Agar cicloserina- Cefotaxina- fructosa	72 hrs.a 35°C Anaerobiosis y EIAs
Clostridium perfringens	Carnes Productos carneos		Agar sangreSupl Agar EYA	72 hrs. A 35°C Anaerobiosis y Detección enterotoxinas
E.coli enteropatógena	Agua alimentos		Mac Conkey Mac Conkey+MUG	24 hrs a 35°C Aerobiosis y serología
E.coli enteroinvasiva	alimentos		MacConkey MacConkey+MUG	24 hrs a 35°C Aerobiosis y serología
E.coli Verotoxigenica	Carnes leche		MacConkey+ sorbitol	24 hrs a 35°C Aerobiosis y serología
Plesiomona shighelloides	Agua mariscos		Agar sangre	48 hrs. A 35°C Atm 5% CO2
Salmonella spp. No tifosa	Huevos, carnes Leche,pescados	Caldo Selenito F 16 a 20 hrs.	Agar XLD Agar Hektoen A.bismuto sulf.	24 hrs a 35°C Aerobiosis y serología
Shighella spp S.dysenteriae Otras Shighella	Agua Mariscos alimentos	Caldo GN 16 hrs. A 35°C	Medio S.S. Medio EMB Mac Conkey	24 hrs. A 35°C Aerobiosis y serología
Staphylococcus aureus	Lacteos, carnes,salsas,cramas		Agar Manitol salado	24 hrs.a 35°C aerobiosis
Vibrio cholerae	Agua Mariscos vegetales	Agua peptonada alcalina 16 a 20 hrs.	Agar TCBS	24 a 48hrs. Aerobiosis y serología
Vibrio parahaemolyticus	Mariscos pescados	Agua peptonada Alcalina 16 a 20 hrs	Agar TCBS	24- 48hrs.a 35°C Aerobiosis y serología
Yersinia enterocolítica	Agua Carnes,alimentos	PBS 4-5°C por 72 hrs.	Agar CIN	24-48hrs a 35°C aerobiosis